XSELECT HSS XP色譜柱入門指南（含連接安裝及平衡）
每根XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱都隨附COA報告和性能測試色譜圖，保存于eCord智能芯片或柱盒內。COA報告為XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱中所用的填料批次所特有，包括填料批號、未鍵合填料和鍵合填料分析結果，以及色譜結果和檢測條件。性能測試色譜圖提供每根色譜柱的以下信息：填料批號、色譜柱序列號、USP理論塔板數、USP拖尾因子、保留因子以及色譜測試條件。這些數據應妥善記錄和保存，以備將來參考或通過ACQUITY UPLC控制臺訪問。
a．色譜柱連接
XP 2.5μm色譜柱專為在任意HPLC、UHPLC或UPLC系統上運行而設計。鑒于缺乏行業標準，所以請注意，不同系統的接頭和連接件類型會因制造商不同而有所差異，安裝時應采用與具體色譜柱相匹配的接頭和連接件。
如果色譜柱末端接頭的類型與壓力螺母/錐箍管路深度設置匹配不佳，色譜性能會受到負面影響，或者可能發生滲漏。
b. 色譜柱安裝
注：下述步驟給出的流速適用于2.1 mm內徑色譜柱。請根據第VI節（其它信息）中給出的流速和壓力指南調整流速。
1. 灌注泵系統，排出含緩沖液的流動相，然后連接色譜柱的入口。
2. 用100%有機流動相（甲醇或乙腈）沖洗色譜柱，泵流速設置為0.1 mL/min，并在5 min內增加至0.5 mL/min。
3. 當流動相可從色譜柱出口自由流出且無氣泡時，停止液流并將色譜柱出口連接至檢測器。這能防止空氣進入檢測系統，使系統更快達到基線平衡。
4. 按照步驟2所述逐漸增加流速。
5. 監控儀器狀態，直到柱壓和基線達到穩定。
c. 盡可能減小譜帶展寬體積
譜帶展寬是系統擴散性的量度，而系統擴散性可影響色譜性能。內部管路直徑和管線連接可顯著影響系統譜帶展寬和色譜性能。管路內徑增大會導致峰過寬和靈敏度降低（圖1）。
d. 測量譜帶展寬體積
注：該測試應在配備UV檢測器的LC系統上進行。
1. 斷開色譜柱與系統的連接，將色譜柱替換為零死體積二通。
2. 將流速設置為1 mL/min。
3. 制備測試混合物（溶于流動相），使其峰高在0.5 AU-1.0 AU范圍內（可使用系統啟動測試混合物，P/N：WAT034544）。
4. 進樣此溶液2-5μL。
5. 采用5-Sigma法測量4.4%峰高處的峰寬：
譜帶展寬(μL) = 峰寬(min) x 流速(μL/min)
（比如，如果峰寬 = 0.1 min，流速 = 1000μL/min，則譜帶展寬 = 100μL）
e. 測量系統延遲體積
測量延遲體積比測量系統譜帶展寬更困難。系統延遲體積是初始梯度條件到達色譜柱柱頭所需體積的量度。在不同LC系統之間轉換方法時，計算系統延遲體積尤其有用。
1. 斷開色譜柱與系統的連接，將色譜柱替換為零死體積二通。
2. 使用乙腈作為流動相A，使用0.05 mg/mL的尿嘧啶乙腈溶液作為流動相B。
3. 監測254 nm處的UV吸光度。
4. 在目標儀器上運行初始方法的流速和預期流速。
5. 采集運行100%流動相A時的基線5 min。
6. 在5 min處，設置流動相B為100%，然后繼續采集數據5 min。
7. 測量100%流動相A和100%流動相B之間的吸光度差值。
8. 測定該吸光度差值的50%處的時間。
9. 計算梯度起點與50%點之間的時間差值。
10. 將時間差值乘以流速，計算出系統體積。
f. 色譜柱平衡
XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱出廠時保存于100%乙腈中。在更換為其它流動相體系之前，務必確保流動相的兼容性。請用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱（色譜柱體積請參閱表3）。當柱壓穩定后，可認為色譜柱已達到平衡。
為了避免流動相緩沖液在色譜柱或系統中發生沉淀，請使用5倍柱體積的水/有機溶劑沖洗色譜柱，其中有機溶劑比例應與所需緩沖流動相中的有機溶劑比例相同或更低（例如，引
入60%甲醇/40%緩沖液流動相之前，應使用60%甲醇水溶液沖洗色譜柱和系統）。
注：如果流動相中的添加劑（如離子對試劑）濃度較低(< 0.2%v/v)，那么完成平衡可能需要100-200倍柱體積的流動相。此外，當流動相中含有甲酸鹽（如甲酸銨、甲酸等）時，平衡時間可能會延長。
g. 正相應用的溶劑轉換
XSelect HSS Cyano XP 2.5μm色譜柱既可用于反相分離，也可用于正相分離。色譜柱出廠時保存于100%乙腈中，可直接用于反相條件。
如果要將XSelect HSS Cyano色譜柱用于正相應用，則必須遵循以下溶劑轉換步驟：
1. 用至少20倍柱體積的100%甲醇沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
2. 用至少20倍柱體積的100%異丙醇沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
3. 用至少20倍柱體積的100%二氯甲烷沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
4. 采用預定的流動相條件沖洗色譜柱，直至基線穩定。
h. eCord安裝
如果色譜柱是安裝在ACQUITY UPLC系統上，在追蹤和管理色譜柱使用情況時，eCord技術具有顯著優勢。將黃色芯片座與ACQUITY UPLC柱溫箱模塊右側的讀/寫裝置相連接，即可
讀取eCord。
諸如色譜柱制造QC數據和COA報告等內置信息隨后可通過ACQUITY UPLC控制臺訪問。
i. 初始柱效測定
1. 使用色譜柱之前，需要先執行柱效測試，以追蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。這項測試可包括：
a. 您所在實驗室常用的分析測試混合物
b. “性能測試色譜圖”（可通過eCord訪問）中的分析混合物。
注：如果采用(b)項的分析物進行柱效測試，那么您所在實驗室在等度條件下測得的柱效可能低于沃特世“性能測試色譜圖”中所示的柱效。
這是正常并且符合預期的。沃特世對等度色譜柱測試系統進行了改造，盡可能減小了系統擴散。目的是更嚴格地測試色譜柱填充質量，同時保證填充柱品質。這些經過改造的特殊測試系統不再具有商業可行性，方法的靈活性亦受限，只能用于等度色譜柱測試。
2. 測定理論塔板數(N)，并定期對比該數值。
3. 定期進行重復測試，以追蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。使用不同的LC系統進行測試，所得柱效結果可能會有微小差異，這可能是由于連接質量、運行環境、系統電子設備、試劑質量、色譜柱條件和操作員技術等因素所致。
j. VanGuard保護柱
VanGuard?保護柱是2.1 mm（內徑）x 5 mm（長）保護柱，可在保護分析柱的同時，盡可能降低使用保護柱帶來的負面擴散影響。VanGuard保護柱填充的固定相與XP 2.5μm系列
色譜柱相同。VanGuard保護柱可直接連接eXtended Performance [XP] 2.5μm色譜柱入口。
注：VanGuard保護柱出廠時配有箍環和錐箍，但并未固定。因此用戶可根據具體的XP 2.5μm色譜柱選用匹配的VanGuard保護柱，確保連接無空隙且無滲漏。
取下將這兩個部件固定至保護柱管路的O形圈時，必須謹慎操作。
VanGuard保護柱安裝說明
1. 將VanGuard保護柱從外盒和包裝套管中取出，取下塑料塞。
2. 固定保護柱，使外接頭朝上，小心地取出在運輸期間用于固定箍環和錐箍的黑色O形圈（箍環和錐箍未進行永（yong）久性連接）。
3. 將XP 2.5μm色譜柱入口朝下，垂直于工作臺表面。
4. 從下方將VanGuard保護柱推入色譜柱入口，然后將色譜柱和保護柱翻轉180°，使保護柱位于上方。
5. 如圖4所示，將兩個5/16英寸扳手分別置于XP色譜柱的平坦部分和VanGuard保護柱六角螺母（外接頭）處，然后擰緊。
6. 將VanGuard保護柱壓在XP 2.5μm色譜柱上，同時擰緊以固定箍環和錐箍。
7. 松開接口并檢查錐箍深度，確保錐箍完全固定。
8. 將保護柱低流速純有機相活化后再重新連接至XP 2.5μm色譜柱前端，設置流速并檢查是否滲漏。
